匯總滅菌方法

高壓蒸汽滅菌法：用高溫加高壓滅菌，不僅可殺死一般的細(xì)菌，對細(xì)菌芽胞也有殺滅效果，是zui-可靠、應(yīng)用zui-普遍的物理滅菌法。主要用于能耐高溫的物品，如金屬器械、玻璃、搪瓷、敷料、橡膠及一些藥物和部分培養(yǎng)基的滅菌。

微生物學(xué)實驗室常用的器材一般包括玻璃器材、金屬器械、橡膠制品及塑料制品等，每類器材的處理及消毒措施都有不同。嚴(yán)格的消毒滅菌工作極為重要，直接影響著整個實驗?zāi)芊耥樌M行。


一、不同種類物品及培養(yǎng)物的消毒滅菌方法


1.無菌操作室滅菌
由于無菌操作室的污染來源主要是空氣中的細(xì)菌和真菌孢子，因此停用后的無菌操作室應(yīng)進行熏蒸滅菌，熏蒸是用高錳酸鉀+甲醛[(2mL甲醛+1g高錳酸鉀)/m3]進行無菌室的滅菌。經(jīng)常使用的無菌操作室，在每次使用前都應(yīng)進行地面衛(wèi)生清潔，并用紫外線燈照射30min，進行空氣滅菌。對超凈工作臺，每次操作前用紫外燈照射30min，然后用70%～75%酒精擦拭。



2.培養(yǎng)液滅菌
培養(yǎng)液在制備過程中帶有各種雜菌，分裝后應(yīng)立即滅菌，至少也應(yīng)在4小時內(nèi)完成滅菌工序。目前常用過濾除菌法除去培養(yǎng)物操作液和培養(yǎng)液中的細(xì)菌。或?qū)ε囵B(yǎng)液中耐熱組分行高壓蒸汽滅菌，然后在無菌室加入經(jīng)過過濾除菌的不耐熱溶液，混勻后分裝備用。



使用高壓蒸汽滅菌器滅菌時，將分裝好的培養(yǎng)液放入底部有一定量(淹沒加熱管)涼水的高壓蒸汽滅菌器內(nèi)，增壓至0.035~0.040 MPa時排凈滅菌器內(nèi)冷空氣，以便使蒸汽能到達(dá)各個消毒部位，保證消毒滅菌*。然后繼續(xù)加壓加熱，當(dāng)壓力表讀數(shù)達(dá)到0.10~0.11MPa為121℃，保持15~20min即可。由于消毒滅菌效果取決于溫度而不是壓力，所以在一定壓力下保持較長的消毒滅菌時間是必須的。



在121℃的蒸汽溫度下可以很快殺死各種細(xì)菌及高度耐熱的芽孢桿菌，因此許多培養(yǎng)液的消毒滅菌壓力、溫度一般保持在0.10~0.11MPa、121℃。消毒滅菌時間與需要消毒滅菌的培養(yǎng)液量密切相關(guān)(表1)，時間不足達(dá)不到滅菌效果，時間過長培養(yǎng)液內(nèi)的一些化學(xué)物質(zhì)遭到破壞，影響培養(yǎng)液成分。消毒滅菌結(jié)束后，關(guān)閉熱源，只有當(dāng)滅菌器內(nèi)壓力降為零時才能打開放氣閥，排除剩余蒸汽，取出培養(yǎng)液。不可在壓力較高時打開放氣閥，引起減壓沸騰，使容器中液體溢出。培養(yǎng)液組成中如含有遇熱易分解的物質(zhì)，則需用過濾方法消毒滅菌。首先對培養(yǎng)液中耐熱組分進行高壓蒸汽滅菌后放置在無菌場所，固體培養(yǎng)液在40℃左右瓊脂即將凝結(jié)前，加入經(jīng)過過濾除菌的不耐熱溶液，混勻后冷卻備用。



3.玻璃器皿、塑料器皿和器械滅菌

玻璃器皿可進行干熱滅菌或高壓蒸汽滅菌，但在蒸汽滅菌后zui-好及時烘干水分。對不能進行高壓蒸汽滅菌的塑料器皿可用75%酒精浸泡，使用前在無菌操作臺面上晾干的同時，用紫外線重復(fù)殺菌。實驗室還可以用環(huán)氧乙烷滅菌袋對塑料器皿進行消毒，消毒后的器皿要充分散氣2～4小時后才可使用。無菌操作所用的各種器械，一般采用干熱或高壓蒸汽滅菌，或用75%酒精浸泡，然后在無菌操作臺面上晾干的同時再用紫外線重復(fù)殺菌；在使用期間可多次對其進行酒精燈火焰灼燒滅菌。



4.培養(yǎng)材料的消毒滅菌
采自動物機體的實驗材料，攜帶著微生物及雜質(zhì)，接種前須進行表面消毒滅菌，對內(nèi)部已受微生物侵染的材料應(yīng)予以淘汰。從動物機體采集的某些組織塊，須用消毒劑進行浸泡處理，進行表面消毒。常用消毒劑有過氧化氫(10~12%，浸泡5~15 min)、過氧乙酸(0.05%，浸泡30s~1min)、酒精(70~75%，浸泡2 min)。



二、消毒滅菌方法

目前，常用的消毒滅菌方法多采用物理方法(如干熱滅菌法、濕熱滅菌法、過濾除菌法、射線殺菌法等)和化學(xué)方法(消毒劑、抗生素)兩大類。



1.干熱滅菌法

是利用恒溫干燥箱內(nèi)160℃～170℃的高熱，并保持90～120分鐘，殺死細(xì)菌和芽孢，達(dá)到滅菌目的的一種方法。主要適用于不便在壓力蒸汽滅菌器中進行滅菌，且不易被高溫?fù)p壞的玻璃器皿、金屬器械以及不能和蒸汽接觸的物品的滅菌。用此方法滅菌的物品干燥，易于貯存。酒精燈火焰燒灼滅菌法也是屬于干熱滅菌的方法之一，在進行微生物檢測工作時，常須利用工作臺面上的酒精燈火焰對金屬器具及玻璃器皿口緣進行補充滅菌。



2.濕熱滅菌法

壓力蒸汽濕熱滅菌法是目前zui常用的一種滅菌方法。它利用高壓蒸汽以及在蒸汽環(huán)境中存在的潛熱作用和良好的穿透力，使菌體蛋白質(zhì)凝固變性而使微生物死亡。適合于布類工作衣、各種器皿、金屬器械、膠塞、蒸餾水、棉塞、紙和培養(yǎng)基的滅菌。高壓蒸汽滅菌器的蒸汽壓力一般調(diào)整為0.10-0.11MPa，維持20～30min即可達(dá)到滅菌效果。



3.射線滅菌法

利用紫外線燈進行照射滅菌的方法。紫外線是一種低能量的電磁輻射，可以殺滅多種微生物。紫外線的作用機制是通過對微生物的核酸及蛋白質(zhì)等的破壞作用而使其滅活。適合于實驗室空氣、地面、操作臺面滅菌。滅菌時間為30min。用紫外線殺菌時應(yīng)注意，不能邊照射邊進行實驗操作，因為紫外線不僅對人體皮膚有傷害，而且對培養(yǎng)物及一些試劑等也會產(chǎn)生不良影響。



4.過濾除菌法
是將液體或氣體通過有微孔的濾膜過濾，使大于濾膜孔徑的細(xì)菌等微生物顆粒阻留，從而達(dá)到除菌的方法。過濾除菌法大多用于遇熱易發(fā)生分解、變性而失效的試劑、酶液、血清、培養(yǎng)基等。

目前，常用微孔濾膜金屬濾器或塑料濾器正壓過濾除菌，或用玻璃細(xì)菌濾器、濾球負(fù)壓過濾除菌。濾膜孔徑應(yīng)在0.22～0.45μm范圍內(nèi)或用更小的細(xì)菌濾膜，溶液通過濾膜后，細(xì)菌和孢子等因大于濾膜孔徑而被阻，并利用濾膜的吸附作用，阻制小于濾膜孔徑的細(xì)菌透過。



5.化學(xué)消毒劑消毒法
用于那些不能利用物理方法進行滅菌的物品、空氣、工作面、操作者皮膚、某些實驗器皿等。常用的化學(xué)消毒劑包括甲醛、高錳酸鉀、70%～75%乙醇、過氧乙酸、來蘇爾水、0.1%新潔爾滅、環(huán)氧乙烷、碘伏或碘酊等。其中利用70%～75%乙醇、0.1%～0.2%氯化-汞、10%次氯酸鈉、飽和漂白-粉等進行實驗材料的滅菌；利用甲醛加高錳酸鉀[(2mL甲醛+1g高錳酸鉀)/m3]或乙二醇(6mL/m3)等加熱熏蒸法進行無菌室和培養(yǎng)室的消毒。在使用時應(yīng)注意安全，特別是用在皮膚或?qū)嶒灢牧仙系南緞?，須選用合適的藥劑種類、濃度和處理時間，才能達(dá)到安全和滅菌的目的。



6.抗生素抑菌法
主要用于培養(yǎng)基，是培養(yǎng)過程中預(yù)防微生物污染的重要手段以及作為微生物污染不嚴(yán)重時的“急救”措施。常用的抗生素有青霉素、鏈霉素和新霉素等。



三、滅菌程序驗證內(nèi)容

撰寫驗證方案及制定評估標(biāo)準(zhǔn)。

確認(rèn)滅菌設(shè)備技術(shù)資料齊全、安裝正確，并能處于正常運行。

確認(rèn)關(guān)鍵設(shè)備控制儀表在規(guī)定的參數(shù)范圍內(nèi)能正常運行。

采用被滅菌物品或模擬物品進行重復(fù)實驗確認(rèn)滅菌效果符合規(guī)定。

完善文件記錄，撰寫驗證報告。



四、滅菌程序運行監(jiān)控

關(guān)鍵參數(shù)應(yīng)在驗證確定的范圍內(nèi)：溫度、壓力、時間、濕度、滅菌氣體濃度、輻照劑量等。

滅菌程序定期驗證，時效不超過半年。

滅菌設(shè)備或程序發(fā)生變更重新進行驗證。



五、滅菌保證

滅菌效果與滅菌前產(chǎn)品污染程度及污染菌特性有關(guān)，把握微生物污染水平及污染菌耐受性，注意各個環(huán)節(jié)降低污染程度。

滅菌冷卻階段防止已滅菌物品再次污染。

適用生物指示劑、化學(xué)指示劑等監(jiān)控滅菌結(jié)果。



六、生物指示劑

基本要求：

菌種的耐受性應(yīng)大于需滅菌產(chǎn)品中所有可能污染菌的耐受性。

菌種應(yīng)無致病性。

菌株應(yīng)穩(wěn)定，存活期長，易于保存。

易于培養(yǎng)。若使用休眠孢子，孢子含量在90%以上。



七、常用生物指示劑

濕熱滅菌：嗜熱脂肪芽孢桿菌孢子（ATCC7953等，活孢子數(shù)為5×105～5×106個/片)。

干熱滅菌：枯草芽孢桿菌孢子（ATCC9372等，活孢子數(shù)為5×105～5×106個/片)。

輻射滅菌：短小芽孢桿菌孢子（ATCC27142等，活孢子數(shù)為5×107～5×108個/片)。