簡(jiǎn)介分光光度法

一、基本原理

光線(xiàn)是高速運(yùn)動(dòng)的光子流，也是具有波長(zhǎng)和頻率特征的電磁波。光子的能量與頻率成正比，與波長(zhǎng)成反比。肉眼可見(jiàn)的光線(xiàn)稱(chēng)為可見(jiàn)光。可見(jiàn)光只占電磁波譜的很窄部分(400nm到760nm)。不同波長(zhǎng)的可見(jiàn)光具有不同的顏色。波長(zhǎng)大于760nm的光線(xiàn)稱(chēng)為紅外線(xiàn)。波長(zhǎng)小于400nm的光線(xiàn)稱(chēng)為紫外線(xiàn)。

當(dāng)一束白光通過(guò)一杯有顏色的溶液時(shí)，具有一定波長(zhǎng)的光線(xiàn)選擇性的被溶液所吸收。不同物質(zhì)由于其分子結(jié)構(gòu)不同，對(duì)不同波長(zhǎng)光線(xiàn)的吸收能力不同，因此每種物質(zhì)都具有其特異的吸收光譜。吸收光譜的測(cè)定可以用來(lái)鑒定各種不同的物質(zhì)。例如核黃素之所以呈現(xiàn)黃色，是由于它僅吸收可見(jiàn)光中的藍(lán)光范圍，并測(cè)得其吸收峰在450nm（圖1-3）。在紫外光范圍它還有兩個(gè)吸收峰。它們分別是260nm和370nm。

分光光度法常被用來(lái)測(cè)定溶液中存在的光吸收物質(zhì)的濃度。其理論依據(jù)是郎伯—比爾(Lambert-Beer)定律。

 （核黃素22mmol/L溶于0.1mol/L  磷酸鈉中，pH7.06，吸收杯厚1cm）

（一）郎伯定律(Lambert’s Laws)

一束單色光在通過(guò)一溶液時(shí)，由于溶液吸收一部分光能，使光的強(qiáng)度減弱。若溶液的濃度不變，則溶液的厚度愈大，光強(qiáng)度的減弱也愈顯著(圖1-4)

若I₀表示入射光強(qiáng)度，I表示光線(xiàn)通過(guò)溶液后的強(qiáng)度，L表示溶液的厚度。

得：InI=－αL＋C       當(dāng)Ｉ=0時(shí)，I=I₀，所以C=InI₀    即  InI=－αL＋I(xiàn)nI₀

K₁是一常數(shù)，受光線(xiàn)波長(zhǎng)、溶液性質(zhì)和溶液濃度影響。從上述公式可知，透過(guò)溶液后，光強(qiáng)度的減弱（I/I₀）與溶液厚度（L）呈指數(shù)函數(shù)關(guān)系。可見(jiàn)光強(qiáng)度的改變與溶液厚度并不呈簡(jiǎn)單的正比關(guān)系。這一關(guān)系就是郎伯定律。

 （二）比爾定律(Beer’s Law)

當(dāng)一束單色光通過(guò)一溶液時(shí)，若溶液的厚度不變，則溶液濃度愈高，光線(xiàn)強(qiáng)度減弱也愈顯著，與上定律相似。兩者的關(guān)系可以表示如下：

其中，C表示溶液的濃度。K₂是一常數(shù)，受光線(xiàn)波長(zhǎng)、溶液性質(zhì)和溶液厚度的影響。上述公式所表示的光強(qiáng)度與溶液濃度的關(guān)系稱(chēng)為比爾定律。

雖然所有的溶液均符合郎伯定律，但并非所有的溶液都符合比爾定律。這是由于有些物質(zhì)在不同濃度條件下其顏色可能發(fā)生改變，即在不同濃度條件下其吸收光的波長(zhǎng)發(fā)生改變。常見(jiàn)的原因如下：

    1．有些有色物質(zhì)在溶液中可能解離成相應(yīng)的離子，離子的顏色與分子的顏色不同，造成對(duì)比爾定律的誤差。

2．有些物質(zhì)在較高濃度狀態(tài)下可形成絡(luò)合物，絡(luò)合物使吸收光譜發(fā)生改變。例如：氯化鈷在稀溶液中呈玫瑰色，而在濃溶液中呈藍(lán)色。

CoCl₂ + CoCl₂→Co2+ (CoCl₄)2-

玫瑰色         藍(lán)色

3．氫離子濃度和電解質(zhì)也可引起一些有色物質(zhì)顏色的改變，這些改變也可能造成比爾定律的誤差。

（三）郎伯——比爾定律及其應(yīng)用

一般將通過(guò)溶液后的光線(xiàn)強(qiáng)度（I）和入射光（Io）的比值稱(chēng)為透光度(transmittance, T)，將-Log  用光密度(Optical density, O.D.或D)表示，以反映該溶液對(duì)光吸收的情況。有時(shí)也用吸光度(absorbance, A)表示。則它們之間的關(guān)系如下

其中，Ｅ為消光系數(shù)(Extinction coefficient), 表示物質(zhì)對(duì)光線(xiàn)吸收的本領(lǐng)，其值因物質(zhì)種類(lèi)和光線(xiàn)波長(zhǎng)而異。

從公式（1）可知對(duì)于相同物質(zhì)和相同波長(zhǎng)的單色光（消光系數(shù)不變）來(lái)說(shuō)，溶液的光密度和溶液的濃度呈正比。

如果C₂為標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，則可根據(jù)測(cè)得的光密度值，按公式（2）求得待測(cè)溶液的濃度。

實(shí)際工作中為簡(jiǎn)便起見(jiàn)，常常不是每測(cè)一個(gè)待測(cè)樣品都做一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)管，而是事先測(cè)定一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)管，然后以光密度對(duì)標(biāo)準(zhǔn)濃度作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，測(cè)得待測(cè)物質(zhì)的光密度后，便可從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上查到相應(yīng)的濃度數(shù)值。

從公式（1）可知，若知道某待測(cè)物質(zhì)的消光系數(shù)和溶液的厚度，也可以從光密度推算出待測(cè)溶液的濃度。消光系數(shù)的常用表示方法有二：

1．百分消光系數(shù)（E1%_1cm）；濃度以百分濃度來(lái)表示的消光系數(shù)。百分消光系數(shù)等于濃度為1%，液層厚度為1cm的光密度值。

2．克分子消光系數(shù)（ε）；濃度以摩爾濃度來(lái)表示的消光系數(shù)?？朔肿酉庀禂?shù)等于溶液濃度為1個(gè)摩爾濃度，液層厚度為1cm的光密度值。

用消光系數(shù)計(jì)算濃度的公式是： 

例：一蛋白質(zhì)溶液在其吸收峰λ=278nm處的光密度D=0.520，吸收杯厚度為1.00cm，已知E1%_1cm278=5.10，則此蛋白質(zhì)溶液的濃度為 

 二、

幾種常用的國(guó)產(chǎn)分光光度計(jì)

（一）721型分光光度計(jì)（圖1-7）   

這是一種采用光電管為受光器的較高級(jí)可見(jiàn)光分光光度計(jì)。由穩(wěn)壓電源供電的光源燈發(fā)出穩(wěn)定的白光。如圖1-7所示。光線(xiàn)經(jīng)反射鏡投入狹縫，再經(jīng)準(zhǔn)直鏡反射進(jìn)入棱鏡，在棱鏡中發(fā)生色散后，光線(xiàn)經(jīng)鋁面反射后，其中一部分經(jīng)原路返回，并穿過(guò)狹縫，透過(guò)反射鏡進(jìn)入吸收杯。從吸收杯射出的光線(xiàn)再經(jīng)光門(mén)射到光電管上，產(chǎn)生相應(yīng)的電流，并經(jīng)電流表指示出相應(yīng)的刻度值。

其中色散棱鏡裝在一個(gè)可以轉(zhuǎn)動(dòng)的圓盤(pán)上，旋轉(zhuǎn)波長(zhǎng)選擇鈕可使之發(fā)生偏轉(zhuǎn)，使不同波長(zhǎng)的光線(xiàn)通過(guò)狹縫形成一定波長(zhǎng)的單色平行光線(xiàn)。同時(shí)，波長(zhǎng)盤(pán)也隨之轉(zhuǎn)動(dòng)以指示波長(zhǎng)數(shù)字。此型分光光度計(jì)給出360~800nm范圍的波長(zhǎng)，在410-710nm之間靈敏、適用。使用方法如下（各調(diào)節(jié)部位參看圖1-8）。

1．靈敏度選擇鈕放在“1”檔（如調(diào)不到“0”時(shí)，再選用較高的檔）。

2．轉(zhuǎn)動(dòng)波長(zhǎng)選擇鈕，選用所需的波長(zhǎng)。

3．接通電源（指示燈亮）。

4．揭開(kāi)比色皿暗箱蓋，轉(zhuǎn)動(dòng)“0”位鈕，使電表指針對(duì)準(zhǔn)T=0處。

5．將比色杯杯放入比色杯架上，使空白管對(duì)向光路，蓋好比色皿暗箱蓋，轉(zhuǎn)動(dòng)“百位鈕”調(diào)準(zhǔn)電表指針使之指向D=0（T=100處）。

6． 拉動(dòng)比色皿座的拉桿，使測(cè)定杯進(jìn)入光路，迅速?gòu)碾姳砩献x出光密度值，記錄。測(cè)讀過(guò)程中，隨時(shí)將拉桿推回到原位，使空白杯進(jìn)入光路，并轉(zhuǎn)動(dòng)“百位鈕”，使指針回到D=0處。

7． 比色完畢后，關(guān)上電源開(kāi)關(guān)，取出比色杯，將比色皿暗箱蓋蓋好，清洗比色皿并空干。

8． 注意事項(xiàng)

（1）光電比色計(jì)屬精密儀器，應(yīng)精心愛(ài)護(hù)使用，要防震、防潮、防腐蝕。

（2）比色杯的好壞對(duì)光密度讀數(shù)的影響很大，要保持比色杯的清潔干凈，保護(hù)光學(xué)面的透明度，不能手握光學(xué)面，也不能用粗糙的物體接觸光學(xué)面，比色杯中的液體應(yīng)適量，不應(yīng)過(guò)滿(mǎn)，比色杯外壁的液體應(yīng)用擦鏡紙擦干，以防腐蝕儀器和影響讀數(shù)。如比色液為強(qiáng)酸強(qiáng)堿，應(yīng)盡快比色，以防破壞比色杯。

（3）比色時(shí)間應(yīng)盡量縮短，以防光電系統(tǒng)疲勞。如需連續(xù)使用，中間應(yīng)適當(dāng)暫停使用，使之避光休息。

（二）UV-754型分光光度計(jì)

這是一種可供在紫外到紅外區(qū)（200-1000nm）測(cè)量吸收光譜的較高級(jí)分光光度計(jì)。此儀器的光學(xué)部分與721型分光光度計(jì)相類(lèi)似，但它采用石英棱鏡作單色光器，有鎢絲燈和氫弧燈兩種光源。754型分光光度計(jì)的電學(xué)部分較為復(fù)雜（圖1-9）。光電流經(jīng)過(guò)放大線(xiàn)路加以放大后，此時(shí)得到的樣品信號(hào)變?yōu)榕c透光率成比例的值。其后，調(diào)零、變換對(duì)數(shù)、濃度計(jì)算、打印數(shù)據(jù)等均由微處理機(jī)進(jìn)行。

儀器的使用方法

1．測(cè)試準(zhǔn)備

（1）打開(kāi)電源開(kāi)關(guān)之前,檢查一下試樣室是否放置遮光物。

（2）試樣槽置“參考”位置。

（3）接電源開(kāi)關(guān)(如果波長(zhǎng)工作在于200～360時(shí)需按氘燈觸發(fā)按鈕)。(參見(jiàn)圖1-9)

顯示器顯示“754”后，數(shù)顯而易見(jiàn)：“100.0”，則表示儀器已通過(guò)自檢程序。

（4）儀器預(yù)熱三十分鐘后開(kāi)始測(cè)試。

測(cè)試

（1）數(shù)顯為100.0后，穩(wěn)定2～3秒鐘，即可把試樣槽置“樣品”位置進(jìn)行測(cè)試。待第-一個(gè)數(shù)據(jù)打印完畢后，再可將試樣槽置第二個(gè)“樣品”位置測(cè)試。

（2）每當(dāng)需要調(diào)換波長(zhǎng)時(shí)，必須把試樣槽置“參考”位置，重新調(diào)滿(mǎn)度。

[注意]：如果在幅度設(shè)定測(cè)試波長(zhǎng)時(shí)，需等待數(shù)分鐘后，才能工作，因這時(shí)光能量變化急劇，使光電管受光后響應(yīng)緩慢，需一段光響應(yīng)平衡時(shí)間。

三、

分光光度計(jì)的結(jié)構(gòu)原理

不論光度計(jì)(Photometers)、比色計(jì)（Colorimenters）還是分光光度計(jì)(Spectrophoto- meters)，其基本結(jié)構(gòu)原理都是相似的，都由光源、單色光器、狹縫、吸收杯和檢測(cè)器系統(tǒng)等部分組成（圖1-5）。

（一）光源

一個(gè)良好的光源要求具備發(fā)光強(qiáng)度高、光亮穩(wěn)定、光譜范圍廣和使用壽命長(zhǎng)等特點(diǎn)。幾乎所有的光度計(jì)都采用穩(wěn)壓調(diào)控的鎢燈(tungsten lamp)。它適用于做340-900nm范圍的光源。更的分光光度計(jì)外加有穩(wěn)壓調(diào)控的氫燈(hydrogen lamp)。它適用于做200 -360nm的紫外分光分析的光源。

（二）單色光器

分光光度法測(cè)定某一物質(zhì)的光密度需要在某一特定波長(zhǎng)下進(jìn)行。單色光器的作用在于根據(jù)需要選擇一定波長(zhǎng)范圍的單色光。在實(shí)際工作中欲選擇出單個(gè)某波長(zhǎng)的光線(xiàn)是困難的。所謂單色光是指在此波長(zhǎng)有zui大發(fā)射，而在相鄰較長(zhǎng)和較短波長(zhǎng)范圍內(nèi)的發(fā)射能量較少而言。單色光的波長(zhǎng)范圍愈窄，儀器的敏感度愈高，測(cè)量的結(jié)果愈可靠。

zui簡(jiǎn)單的單色光器是光電比色計(jì)上所采用的濾光片（一定顏色的玻璃片）。由于通過(guò)光線(xiàn)的光譜范圍較寬，所以光電比色計(jì)的分辨效果較差，但對(duì)比色分析還是可以得到較為滿(mǎn)意的效果的。棱鏡(Prism)的衍射光柵(diffraction grating)是較好的單色光器。它們能在較寬光譜范圍內(nèi)分離出相對(duì)單一波長(zhǎng)的光線(xiàn)（圖1-6）。

（三）狹縫

通過(guò)單色光器的發(fā)射光的強(qiáng)度可能過(guò)強(qiáng)也可能過(guò)弱不利于進(jìn)一步檢測(cè)。狹縫是由一對(duì)隔板在光通路上形成的狹縫。通過(guò)調(diào)節(jié)狹縫的大小來(lái)調(diào)節(jié)入射單色光強(qiáng)度并使入射光形成平行光線(xiàn)，以適應(yīng)檢測(cè)器的需要。光電比色計(jì)的狹縫是固定的，而光度計(jì)和分光光度計(jì)的狹縫大小是可調(diào)的。

（四）吸收杯

吸收杯又叫樣品杯(Sample Cell)，是光度測(cè)量系統(tǒng)的重要部分之一。在可見(jiàn)光范圍內(nèi)測(cè)量時(shí)選用光學(xué)玻璃吸收杯，在紫外線(xiàn)范圍內(nèi)測(cè)量時(shí)要選用石英吸收杯。注意保護(hù)吸收杯的質(zhì)量是取得好的分析結(jié)果的重要條件之一。不得用粗糙、堅(jiān)硬物質(zhì)接觸吸收杯，不能用手指握取吸收杯的光學(xué)面；用后要用水及時(shí)沖洗，不得殘留測(cè)定液，尤其是蛋白質(zhì)和核酸溶液。

（五）檢測(cè)器系統(tǒng)

硒光電池、光電管或光電倍增管等光電元件常用來(lái)作為受光器，將通過(guò)吸收杯的光線(xiàn)（I）的能量轉(zhuǎn)變成電能。進(jìn)一步再用適當(dāng)?shù)姆椒y(cè)量所產(chǎn)生的電流。

光電比色計(jì)用硒光電池為受光器。硒光電池的光敏感性低。它不能檢出強(qiáng)度非常弱的光線(xiàn)。并且，對(duì)波長(zhǎng)在270nm以下和700nm以上的光波不敏感。

較精密的分光光度計(jì)都是采用真空光電管或光電倍增管作為受光器的，并采用放大裝置以提高敏感度。雖然光譜范圍狹窄的單色光的能量比范圍寬的弱很多，但這種有放大線(xiàn)路的靈敏檢測(cè)系統(tǒng)仍可能準(zhǔn)確地檢測(cè)出來(lái)。